I-BIOMOLÉCULAS. TEMA 0. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA.

TEMA 1- MÉTODOS - PRESENTACIÓN SLIDESHARE

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MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA

CLASIFICACIÓN

Clasificaremos los métodos que se utilizan para el estudio de la célula en dos grandes grupos:

I) Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la composición y relacionar esta composición con las estructuras celulares. Estos métodos son:

a) Centrifugación

b) Cromatografía

c) Electroforesis

d) Cultivos "in vitro"

II) Técnicas para el estudio morfológico de la célula. Nos permiten conocer cómo es su forma, su tamaño y su estructura. Son, fundamentalmente:

a) Microscopía óptica

b) Microscopía electrónica

1) Microscopio electrónico de Trasmisión (MET)

2) Microscopio electrónico de barrido (MEB)

I) TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE LA CÉLULA

Este tipo de métodos se utilizan para el aislamiento, localización e identificación de las sustancias que constituyen la materia viva.

Presentan dos problemas principalmente:

a) Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas.

b) La mayoría de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de una gran complejidad.

Pensemos, por ejemplo, que una sola de los varios miles de proteínas que contiene una célula puede estar formada por más 5000 aminoácidos.

Pasemos a continuación al estudio de cada uno de estos métodos.

A) CENTRIFUGACIÓN

Consiste en la separación de los componentes de una mezcla en función de las diferencias entre las velocidades que presentan al someterlos a elevadas aceleraciones (g). Esto se consigue haciendo girar la mezcla en un rotor a un gran número de vueltas por minuto. Los aparatos empleados con este fin se denominan ultracentrífugas.

Esta técnica requiere los siguientes pasos:

1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACIÓN: El material biológico, por ejemplo: un fragmento de tejido del hígado, es triturado para disgregarlo y romper las membranas celulares.

La rotura de las membranas deja en libertad los orgánulos celulares y el contenido del hialoplasma. Si la homogeneización se realiza suavemente, los orgánulos permanecerán intactos. Obtendremos así una "papilla" que estará compuesta de restos de membranas, orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua.

2) CENTRIFUGACIÓN: Las ultracentrífugas son máquinas que consiguen velocidades de rotación muy elevadas, hasta 500.000 v/mn. En el interior de estos aparatos se alcanzan grandes aceleraciones que se miden en g (1g=9,8 m/s2). En una ultracentrífuga pueden alcanzarse hasta 100.000 g. Los materiales biológicos sometidos a estas aceleraciones se desplazan hacia el fondo de los recipientes que los contienen con velocidades que dependen de su masa, de su forma y volumen, y de la naturaleza del medio en el que se realice la centrifugación.

B) CROMATOGRAFÍA

Se fundamenta en la separación de los componentes de una mezcla por sus diferencias de absorción. Éstas diferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van der Wals que se establecen entre los componentes de la mezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria. Según la naturaleza de la fase estacionaria, tendremos los siguientes tipos de cromatografía:

1) CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL: Se emplea para la separación de sustancias químicas que presenten propiedades muy parecidas. Se opera de la siguiente manera. Una pequeña cantidad de la mezcla a separar se deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que quedará embebida. A continuación se introduce el borde del papel en una sustancia en la que sean solubles los componentes de la mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazará por capilaridad y los irá arrastrando. Los componentes de la mezcla viajarán más o menos rápido según establezcan fuerzas más o menos grandes con las moléculas del papel. Para observar los componentes ya separados se emplean reacciones coloreadas específicas.

2) CROMATOGRAFÍA DE GASES: El aparato consiste en un serpentín largo y delgado cuyas paredes están impregnadas de un líquido (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentín transportada por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los diferentes componentes de la mezcla. Éstos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo que aumenta la conductividad eléctrica del detector. Este método tiene la ventaja de necesitar pequeñísimas cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias muy parecidas químicamente; por ejemplo: ácidos grasos,azúcares u hormonas.

C) ELECTROFORESIS

En este método, la mezcla a separar se deposita en una cubeta sobre un soporte de tipo poroso (acetato de celulosa o también gel de almidón). A continuación se establece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte. Las sustancias que componen la mezcla se desplazarán en función de su carga eléctrica.

Naturalmente este método se empleará con sustancias que presenten cargas eléctricas (proteínas y ácidos nucléicos)

D) CULTIVOS IN VITRO

Estos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismo en condiciones favorables a su multiplicación. La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biológico y su estandarización.

Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones físicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos períodos de tiempo.

II) MÉTODOS MORFOLÓGICOS

Los métodos morfológicos nos van a permitir la observación directa de la estructura celular.

El ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre sí 0,2 mm. Éste es el poder separador o poder de resolución del ojo. Las células de mamífero suelen tener unos 0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellas detalles estructurales. El microscopio va a permitir su observación al aumentar el poder de resolución del ojo.

CLASES DE MICROSCOPIOS

A) MICROSCOPIO ÓPTICO O FOTÓNICO

1) FUNDAMENTO: Funciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa envía rayos de luz a una primera lente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar. Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagen aumentada de éste. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por el objetivo. Esta última imagen es la que será recibida por el observador.

2) PREPARACIÓN DEL MATERIAL: En el microscopio óptico la luz atraviesa el objeto a observar. Si éste es muy grueso, la luz no lo atravesará y el objeto aparecerá demasiado oscuro; además se superpondrán los diferentes planos dando una imagen borrosa. Si el objeto es demasiado delgado o muy transparente, no se observarán sus estructuras. En cualquier caso, deberemos realizar una preparación.

En general, una preparación requiere las siguientes etapas

1- CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados microtomos. Éstos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor, corrientemente entre 3 μ y 20 μ. El tejido destinado al corte debe congelarse o incluirse en parafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad.

2- FIJACIÓN. Su fin es matar a las células con la menor alteración de las estructuras posible, para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismo celular o por la descomposición. Como fijadores se emplean determinadas sustancias químicas (por ejemplo: formaldehído y tetróxido de osmio).

3- DESHIDRATACIÓN. La extracción del agua del interior de las células permitirá también una mejor conservación y la penetración de los colorantes. Para deshidratar el material a observar se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduación que por dilución irán extrayendo el agua.4- TINCIÓN. Es la coloración de las células o de partes de éstas para que resalten y posibilitar así su observación. Algunos colorantes son selectivos pues tiñen partes concretas de la célula.

Existen dos clases de colorantes:

a) Los colorantes vitales. Que tiñen las estructuras celulares pero sin matar a las células (por ejemplo: el verde jano, el rojo neutro, el azul tripán, el azul de metileno).

b) Los colorantes no vitales. Que matan a las células (eosina, hematoxilina).

5- MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre un porta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y "cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duración limitada y sólo sirven para la observación momentánea o a lo sumo de unos días. Si se desea una mayor duración debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina o en euparal.

B) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Existen dos clases de microscopios electrónicos:

B1) Microscopio electrónico de trasmisión (MET).

B2) Microscopio electrónico de barrido (MEB).

B1) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)

1) FUNDAMENTO:

El microscopio electrónico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos teóricos de De Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partículas. Como ondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al ser partículas negativas pueden ser desviadas por campos eléctricos que actúan como lentes.

En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio óptico. Un cátodo emite un haz de electrones que son acelerados por la aplicación de una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primera lente magnética que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra. Una segunda lente magnética, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Una tercera lente, el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen final es proyectada sobre una pantalla o fotografiada.

Los microscopios electrónicos permiten aumentos útiles que van de 2000 a 100.000 pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrónicos son aparatos de hasta 2 m de alto y llegan a pesar 500 kg.

2) PREPARACIÓN del MATERIAL

Los electrones necesitan desplazarse en el vacío, esta es la razón por la que no es posible la observación de células vivas al microscopio electrónico.

2-1) FIJACIÓN. Las células son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los más corrientes son el tetróxido de osmio (OsO₄), el formaldehído (HCHO) y el permanganato potásico (MnO₄K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan selectivamente a las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan más los metales aparecerán más oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo de fijador utilizado.

2-2) DESHIDRATACIÓN e INCLUSIÓN. La pieza es deshidratada e infiltrada mediante una resina o plástico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte.

2-3) CORTE. Los cortes se realizan mediante ultramicrotomos de cuchilla de vidrio o de diamante. Los cortes más finos (0,03μ) son depositados sobre un tamiz y dispuestos para su observación al microscopio.

B2) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)

Este tipo de microscopio permite obtener imágenes tridimensionales del objeto a estudiar. Primero se efectúa un sombreado metálico de la superficie de la muestra, y la réplica obtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se forman son captados y convertidos en imágenes sobre una pantalla de televisión. Estos microscopio son muy útiles para revelar estructuras anatómicas submicroscópicas, sin embargo su aumento no suele pasar de 20.000.